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生物安全柜的工作原理主要是将柜内空气向外抽吸，使柜内保持负压状态，通过垂直气流来保护工作人员；外界空气经高效空气过滤器过滤后进入安全柜内，以避免处理样品被污染；柜内的空气也需经过HEPA过滤器过滤后再排放到大气中，以保护环境。
生物安全柜有两个主要目的：防止污染以保护样品，并保护操作者和实验环境免受样品污染。大多数生物安全柜采用过滤器和均匀的气流，在柜体的外部和内部之间形成一个不可见的屏障。如果功能正常，这将保护样品不受污染物（如微生物和核酸酶）的影响。
使用生物安全柜时，确保样品只能遇到无污染的空气是至关重要的。除了使用过滤器外，您还可以通过尽量减少对生物安全柜的干扰来实现此目的。在开始之前，确保你需要的所有东西都在生物安全柜内部，避免手臂快速移动，因为这可能会引起湍流，从而改变里面的气流。
生物安全柜使用五大原则：
1、缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态，柜内操作时手应该尽量平缓移动。
2、物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象产生，在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开，避免回风过程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。
3、避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器（例如离心机、旋涡振荡器等）的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落，导致操作室内部洁净度降低，同时如果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。
4、不同样品柜内移动原则：柜内两种及以上物品需要移动时，一定遵循低污染性物品向高污染性物品移动原则。
5、明火使用原则：柜内尽量不要使用明火。因为在明火使用过程中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域，这些高温杂质会损伤滤膜。
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